Um novo coronavírus em pacientes com pneumonia na China, 2019 - NEJM 24jan2020

Em dezembro de 2019, um grupo de pacientes com pneumonia de causa desconhecida foi vinculado a um mercado atacadista de frutos do mar em Wuhan, China. Um betacoronavírus previamente desconhecido foi descoberto por uso de sequenciamento imparcial em amostras de pacientes com pneumonia. Células epiteliais das vias aéreas humanas foram usadas para isolar um novo coronavírus, chamado 2019-nCoV, dentro do subgênero sarbecovírus, subfamília Orthocoronavirinae. Diferente do MERS-CoV e do SARS-CoV, o 2019-nCoV é o sétimo membro da família dos coronavírus que infectam seres humanos.

Patógenos emergentes e reemergentes são desafios globais para a saúde pública. Os coronavírus são vírus de RNA envelopados amplamente distribuídos entre humanos, outros mamíferos e aves e causam doenças respiratórias, entéricas, hepáticas e neurológicas. Sabe-se que seis espécies de coronavírus causam doenças humanas. Quatro vírus - 229E, OC43, NL63 e HKU1 - são predominantes e geralmente causam sintomas comuns de resfriado em indivíduos imunocompetentes. As duas outras cepas - coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV) e coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) - são de origem zoonótica e têm sido associadas a doenças, por vezes, fatais. O SARS-CoV foi o agente causal dos surtos graves da síndrome respiratória aguda em 2002 e 2003 na província de Guangdong, China. MERS-CoV foi o patógeno responsável por surtos graves de doenças respiratórias em 2012 no Oriente Médio.

Dada a alta prevalência e ampla distribuição de coronavírus, a grande diversidade genética e a recombinação frequente dos genomas e o aumento das atividades da interface homem-animal, é provável que surjam periodicamente novos coronavírus em humanos devido a infecções freqüentes entre espécies e eventos ocasionais de derramamento.

No final de dezembro de 2019, várias unidades de saúde locais relataram grupos de pacientes com pneumonia de causa desconhecida que estavam epidemiologicamente ligados a um mercado atacadista de frutos do mar e animais úmidos em Wuhan, província de Hubei, China. Em 31 de dezembro de 2019, o Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (China CDC) enviou uma equipe de resposta rápida para acompanhar as autoridades de saúde da província de Hubei e da cidade de Wuhan e conduzir uma investigação epidemiológica e etiológica.

Relatando os resultados desta investigação, identificando a fonte dos aglomerados de pneumonia e foram descritos um novo coronavírus detectado em pacientes com pneumonia cujas amostras foram testadas pelo CDC da China em um estágio inicial do surto. Também foram descritas características clínicas da pneumonia em dois desses pacientes.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL

Quatro amostras do trato respiratório inferior, incluindo líquido de lavagem broncoalveolar, foram coletadas de pacientes com pneumonia de causa desconhecida que foram identificados em Wuhan em 21 de dezembro de 2019 ou posterior e que estavam presentes no mercado de frutos do mar de Huanan perto da época da apresentação clínica. Sete amostras de fluido de lavagem broncoalveolar foram coletadas de pacientes nos hospitais de Pequim com pneumonia de causa conhecida para servir como amostras de controle.

A extração de ácidos nucléicos de amostras clínicas (incluindo culturas não infectadas que serviram como controle negativo) foi realizada com um kit de ácido nucleico viral de alta pureza, conforme descrito pelo fabricante (Roche). Amostras de ácido nucleico extraídas foram testadas quanto a vírus e bactérias por reação em cadeia da polimerase (PCR).

As amostras foram analisadas quanto a 22 patógenos (18 vírus e 4 bactérias). Além disso, o sequenciamento imparcial e de alto rendimento, descrito anteriormente ,foi usado para descobrir sequências microbianas não identificáveis ​​pelos meios descritos acima. Um ensaio de PCR de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) foi usado para detectar RNA viral, visando uma região RdRp consensual de β-CoV pan.

ISOLAMENTO VIRAL

As amostras de fluido de lavagem broncoalveolar foram coletadas em copos estéreis aos quais foi adicionado meio de transporte de vírus. As amostras foram então centrifugadas para remover detritos celulares. O sobrenadante foi inoculado em células epiteliais das vias aéreas humanas, que foram obtidas a partir de amostras de vias aéreas ressecadas de pacientes submetidos a cirurgia para câncer de pulmão e confirmadas como livres de patógenos especiais pelo NGS.

Células epiteliais das vias respiratórias humanas foram expandidas sobre um substrato de plástico para gerar células de passagem-1 e foram subsequentemente colocadas em placas a uma densidade de 2,5 x 105 partículas em suportes permeáveis Transwell-COL (12 mm de diâmetro). As culturas de células epiteliais das vias aéreas humanas foram geradas em uma interface ar-líquido por 4 a 6 semanas para formar culturas polarizadas e bem diferenciadas, semelhantes ao epitélio mucociliar pseudoestratificado in vivo.

Antes da infecção, as superfícies apicais das células epiteliais das vias aéreas humanas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato; 150 μl de sobrenadante de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar foram inoculados na superfície apical das culturas de células. Após uma incubação de 2 horas a 37° C, o vírus não ligado foi removido por lavagem com 500 ml de solução salina tamponada com fosfato por 10 minutos; células epiteliais das vias aéreas humanas foram mantidas em uma interface ar-líquido incubada a 37° C com 5% de dióxido de carbono. A cada 48 horas, 150 μl de solução salina tamponada com fosfato eram aplicados nas superfícies apicais das células epiteliais das vias aéreas humanas e, após 10 minutos de incubação a 37° C, as amostras eram colhidas. As células epitélio mucociliares pseudoestratificadas foram mantidas nesse ambiente; amostras apicais foram passadas em um estoque de frasco diluído 1: 3 para novas células. As células foram monitoradas diariamente com microscopia de luz, para efeitos citopáticos, e com RT-PCR, para a presença de ácido nucleico viral no sobrenadante. Após três passagens, amostras apicais e células epiteliais das vias aéreas humanas foram preparadas para microscopia eletrônica de transmissão.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

O sobrenadante das culturas de células epiteliais das vias aéreas humanas que apresentaram efeitos citopáticos foi coletado, inativado com paraformaldeído a 2% por pelo menos 2 horas e ultracentrifugado para sedimentar partículas de vírus. O sobrenadante enriquecido foi corado negativamente em grades revestidas por película para exame. As células epiteliais das vias aéreas humanas mostrando efeitos citopáticos foram coletadas e fixadas com paraformaldeído a 2% de glutaraldeído a 2,5% e depois fixadas com tetróxido de ósmio a 1% desidratado com etanol de grau embebido em resina PON812. As seções (80 nm) foram cortadas do bloco de resina e coradas com acetato de uranil e citrato de chumbo, separadamente. As grades coradas negativas e as seções ultrafinas foram observadas sob microscopia eletrônica de transmissão.

SEQUENCIAMENTO DO GENOMA VIRAL

O RNA extraído do líquido de lavagem broncoalveolar e sobrenadantes da cultura foi usado como modelo para clonar e sequenciar o genoma. Utilizamos uma combinação de sequenciamento Illumina e seqüenciamento de nanoporos para caracterizar o genoma do vírus. As leituras de sequência foram montadas em mapas de contig (um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos) com o uso do software CLC Genomics, versão 4.6.1 (CLC Bio). Iniciadores específicos foram subsequentemente projetados para PCR, e RACE 5 'ou 3' (amplificação rápida das extremidades de cDNA) foi usada para preencher as lacunas do genoma do sequenciamento Sanger convencional. Estes produtos de PCR foram purificados a partir de géis e sequenciados com um Kit de Sequenciação em Ciclo BigDye Terminator v3.1 e um Analisador Genético 3130XL, de acordo com as instruções do fabricante.

O alinhamento de múltiplas sequências do 2019-nCoV e as sequências de referência foram realizadas com o uso do músculo. A análise filogenética dos genomas completos foi realizada com RAxML (13), com 1000 repetições de bootstrap e um modelo geral reversível no tempo, usado como modelo de substituição de nucleotídeos.

RESULTADOS

PACIENTES

Três pacientes adultos apresentaram pneumonia grave e foram admitidos em um hospital em Wuhan em 27 de dezembro de 2019. O paciente 1 era uma mulher de 49 anos, o paciente 2 era um homem de 61 anos e o paciente 3 era um homem de 32 anos.

Os perfis clínicos estavam disponíveis para os pacientes 1 e 2. O paciente 1 relatou não ter condições médicas crônicas subjacentes, mas relatou febre (temperatura de 37° C a 38° C) e tosse com desconforto torácico em 23 de dezembro de 2019. Quatro dias após o início da a doença, a tosse e o desconforto pioraram, mas a febre foi reduzida; o diagnóstico de pneumonia foi baseado em tomografia computadorizada (TC). Sua ocupação era varejista no mercado atacadista de frutos do mar.

O paciente 2 relatou inicialmente febre e tosse em 20 de dezembro de 2019 (Figura 1 ), momento em que a ventilação mecânica foi iniciada. Ele era um visitante frequente do mercado atacadista de frutos do mar.

Os pacientes 1 e 3 se recuperaram e receberam alta do hospital em 16 de janeiro de 2020. O paciente 2 morreu em 9 de janeiro de 2020. Não foram obtidas amostras de biópsia.

DETECÇÃO E ISOLAMENTO DE UM NOVO CORONAVÍRUS

Três amostras de lavado broncoalveolar foram coletadas no Hospital Wuhan Jinyintan em 30 de dezembro de 2019. Nenhum patógeno específico (incluindo HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 e HCoV-HKU1) foi detectado em amostras clínicas desses pacientes pelo RespiFinderSmart22kit. O RNA extraído do líquido de lavagem broncoalveolar dos pacientes foi usado como modelo para clonar e sequenciar um genoma usando uma combinação de sequenciamento Illumina e sequenciamento nanopore. Foram obtidas mais de 20.000 leituras virais de amostras individuais, e a maioria dos contigs correspondia ao genoma da linhagem B do gênero betacoronavírus - mostrando mais de 85% de identidade com um CoV semelhante a SARS de morcego (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1) genoma publicado anteriormente. Também foram obtidos resultados positivos com o uso de um teste de RT-PCR em tempo real para RNA direcionado a uma região RdRp consensual de pan β-CoV (embora o valor do limiar do ciclo fosse superior a 34 para amostras detectadas). O isolamento do vírus das amostras clínicas foi realizado com células epiteliais das vias aéreas humanas e linhas celulares Vero E6 e Huh-7. O vírus isolado foi nomeado 2019-nCoV.

Para determinar se as partículas virais poderiam ser visualizadas nas células epiteliais das vias aéreas humanas infectadas com nCoV 2019, as culturas epiteliais das vias aéreas humanas infectadas com 2019 e nCoV foram examinadas com microscopia de luz diariamente e com microscopia eletrônica de transmissão 6 dias após a inoculação. Os efeitos citopáticos foram observados 96 horas após a inoculação nas camadas superficiais das células epiteliais das vias aéreas humanas; foi observada uma falta de batimento do cílio com microcópia leve no centro do foco (Figura 2). Não foram observados efeitos citopáticos específicos nas linhas celulares Vero E6 e Huh-7 até 6 dias após a inoculação.

Figura 2 - Efeitos citopáticos em culturas de células epiteliais das vias aéreas humanas após uma inoculação com 2019-nCoV.

As micrografias eletrônicas de partículas 2019-nCoV coradas negativas eram geralmente esféricas com algum pleomorfismo (Figura 3). O diâmetro variou de cerca de 60 a 140 nm. As partículas virais apresentaram picos bastante distintos, de 9 a 12 nm, e deram aos virions a aparência de uma coroa solar. Foram encontradas partículas de vírus livres extracelulares e corpos de inclusão cheios de partículas de vírus em vesículas ligadas à membrana no citoplasma nas seções ultrafinas epiteliais das vias aéreas humanas. Essa morfologia observada é consistente com a família Coronaviridae.

Figura 3 – Visualização do 2019-nCoV com microscopia eletrônica de transmissão.

Para caracterizar ainda mais o vírus, sequências de novo do genoma 2019-nCoV de amostras clínicas (líquido de lavagem broncoalveolar) e isolados de vírus de células epiteliais das vias aéreas humanas foram obtidas por Illumina e seqüenciamento de nanoporos. O novo coronavírus foi identificado nos três pacientes. Duas sequências quase completas de coronavírus foram obtidas do líquido de lavagem broncoalveolar (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-04/2020, BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-05/2020 | EPI_ISL_402121) e uma sequência completa foi obtida de um vírus isolado de um paciente (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01/2020 | EPI_ISL_402119). Sequências genômicas completas dos três novos coronavírus foram submetidas ao GASAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01/2019, ID de acesso: EPI_ISL_402119; BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-04/2020, ID de acesso: EPI_ISL_402120; BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-05/2019, ID da acessão: EPI_ISL_402121) e tem uma identidade de sequência de nucleotídeos de 86,9% de um genoma de CoV semelhante a SARS do bastão publicado anteriormente (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1). Os três genomas de 2019-nCoV se agruparam e formaram um subclado independente dentro do subgênero sarbecovírus, que mostra a organização típica de betacoronavírus: uma região não traduzida a 5 '(UTR), complexo de replicase (orf1ab), gene S, gene E, gene M, N gene, 3 'UTR e vários quadros de leitura abertos não estruturais não identificados.

Embora 2019-nCoV seja semelhante a alguns betacoronavírus detectados em morcegos (Figura 4), é distinto de SARS-CoV e MERS-CoV. Os três coronavírus 2019-nCoV de Wuhan, juntamente com duas cepas do tipo SARS derivadas de morcego, ZC45 e ZXC21, formam um clado distinto na linhagem B do subgênero sarbecovírus. Cepas de SARS-CoV de humanos e coronavírus geneticamente similares a SARS de morcegos coletados no sudoeste da China formaram outro clado no subgênero sarbecovírus. Como a identidade da sequência nos domínios da replicase conservada (ORF 1ab) é inferior a 90% entre 2019-nCoV e outros membros do betacoronavírus, o 2019-nCoV - o provável agente causador da pneumonia viral em Wuhan - é um novo betacoronavírus pertencente ao grupo subgênero sarbecovírus da família Coronaviridae.

Figura 4 - Análise filogenética de 2019-nCoV e outros genomas de betacoronavírus na subfamília Orthocoronavirinae.

DISCUSSÃO

Relatamos um novo CoV (2019-nCoV) que foi identificado em pacientes hospitalizados em Wuhan, China, em dezembro de 2019 e janeiro de 2020. As evidências para a presença desse vírus incluem a identificação no líquido de lavagem broncoalveolar em três pacientes por sequenciamento de genoma inteiro , PCR direto e cultura. A doença que provavelmente foi causada por esse CoV foi denominada de uma "nova pneumonia infectada por coronavírus" (NCIP). Os genomas completos foram submetidos ao GASAID. A análise filogenética revelou que o 2019-nCoV se enquadra no gênero betacoronavírus, que inclui os coronavírus (SARS-CoV, CoV semelhante ao SARS do morcego e outros) descobertos em humanos, morcegos e outros animais selvagens. 15 Relatamos o isolamento do vírus e a descrição inicial de seus efeitos citopáticos e morfologia específicos.

Técnicas moleculares têm sido usadas com sucesso para identificar agentes infecciosos por muitos anos. O seqüenciamento imparcial e de alto rendimento é uma ferramenta poderosa para a descoberta de patógenos. O sequenciamento e a bioinformática da próxima geração estão mudando a maneira como podemos responder a surtos de doenças infecciosas, melhorando nossa compreensão da ocorrência e transmissão de doenças, acelerando a identificação de patógenos e promovendo o compartilhamento de dados. Descrevemos neste relatório o uso de técnicas moleculares e seqüenciamento de DNA imparcial para descobrir um novo betacoronavírus que provavelmente foi a causa de pneumonia grave em três pacientes em Wuhan, China.

Embora o estabelecimento de culturas de células epiteliais das vias aéreas humanas seja trabalhoso, elas parecem ser uma valiosa ferramenta de pesquisa para análise de patógenos respiratórios humanos.

Nosso estudo mostrou que a propagação inicial de secreções respiratórias humanas em culturas de células epiteliais das vias aéreas humanas, seguida por microscopia eletrônica de transmissão e sequenciamento genômico completo do sobrenadante da cultura, foi usada com sucesso para visualização e detecção de novos coronavírus humanos que possivelmente podem iludir a identificação por abordagens tradicionais.

Ainda é necessário o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos para identificar patógenos respiratórios desconhecidos. Com base na análise de três genomas completos obtidos neste estudo, projetamos vários ensaios específicos e sensíveis direcionados às regiões ORF1ab, N e E do genoma 2019-nCoV para detectar RNA viral em amostras clínicas. Os conjuntos de primers e os procedimentos operacionais padrão foram compartilhados com a Organização Mundial da Saúde e destinam-se à vigilância e detecção da infecção por 2019-nCoV globalmente e na China. Dados mais recentes mostram a detecção de 2019-nCoV em 830 pessoas na China.

Embora nosso estudo não cumpra os postulados de Koch, nossas análises fornecem evidências que implicam 2019-nCoV no surto de Wuhan. Evidências adicionais para confirmar o significado etiológico de 2019-nCoV no surto de Wuhan incluem a identificação de um antígeno 2019-nCoV no tecido pulmonar de pacientes por análise imuno-histoquímica, detecção de anticorpos antivirais IgM e IgG nas amostras de soro de um paciente em duas ocasiões pontos para demonstrar soroconversão e experimentos com animais (macaco) para fornecer evidências de patogenicidade. De importância crítica são as investigações epidemiológicas para caracterizar modos de transmissão, intervalo de reprodução e espectro clínico resultantes da infecção para informar e refinar estratégias que podem prevenir, controlar e impedir a propagação do 2019-nCoV.

Este artigo foi publicado em 24 de janeiro de 2020, no NEJM.org.

Tradução de:

Na Zhu et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. The New England Journal of Medicine. 24 jan 2020.

Available: https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2001017